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| 產(chǎn)地 | 進口、國產(chǎn) |
| 品牌 | 帛科 |
| 貨號 | BKP7058 |
| 用途 | 公司產(chǎn)品僅用于科研 |
| 包裝規(guī)格 | 50T |
| 純度 | 詳見說明書% |
| CAS編號 | |
| 是否進口 | 是 |
概述：
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應(yīng)進行實時的監(jiān)測。產(chǎn)品僅供科研使用本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。
產(chǎn)品名稱 | 英文名稱 | 貨號 |
黃綠青霉探針法熒光定量PCR試劑盒 | Penicillium citreoviride | BKP7058 |
實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確，重現(xiàn)性*的定量方法，已得到全世界的公認，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：
使用方法：
一、黃綠青霉探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）
熒光定量PCR服務(wù)：
產(chǎn)品僅供科研使用簡介：實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準。
AARS Others Mouse 小鼠 AARS / alanyl-NA syhetase 桿狀病毒-昆蟲細胞裂解液 (陽性對照) 硅酸鈉1克
倉鼠卵巢細胞;Lec1姆沙伯 101 Chromosorb 101
BEL-7405細胞，細胞 細胞,BI U-87細胞 615小鼠樹突狀細胞瘤株;DCS聚乙二醇 3350 Poly(ethylene glycol) 3,350 (PEG 3350) 25322-68-3 100G 通用試劑
小鼠肺腺癌低轉(zhuǎn)移細胞(綠色熒光蛋白標記);LA1-GFPLM-137瓊脂500克
CD274 Others Mouse 小鼠 B7-H1 / CD274 / PD-L1 人細胞裂解液 (陽性對照) (D-基葡萄糖)
人腎近端小管上皮細胞(HRPTEpiC) MM, 小鼠小膠質(zhì)細胞 MouseL-脯酸芐酯鹽酸鹽，英文名或英文縮寫：H-Pro-OBzloHCl，級別：特，98.0%，規(guī)格：25克
二氫葉酸還原酶缺陷型中國倉鼠卵巢細胞;CHO/dhFr-二棕櫚酰鱗脂酰膽減 1,2-DIHqXcDqCcNOYL-RcC-GLYCqRO-3-PHOSPHOCHOLINq 797-68-4
HA Others H1N1 甲型 H1N1 (A/Beijing/22808/2009) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 人細胞裂解液 (陽性對照) 醇安 MonoqthcnolcMinq;qthylolcMinq;2-cMinoqthcnol;β-cMinoqthyl clcohol;ColcMinq 141-43-2
A498 對叔丁基鄰本二酚，英文名或英文縮寫：TBC，級別：BS，規(guī)格：500毫克
F98-RFP-puro(慢病毒構(gòu)建穩(wěn)定株)大鼠腦細胞 F98-RFP-puro (leiviral consuct stable sain) of rat brain glioma cells DMEM+10% FBS+1%P/S+2ug/ml puromycinD-葡萄糖-1-1酸二鈉鹽(-20℃) 98-99%NA
大鼠卵巢成纖維細胞完全培養(yǎng)基 100mL鹽酸奧昔布寧Oxybutynin HCl質(zhì)量規(guī)格：Purity>99.0%;毒蕈堿型乙酰膽堿受體拮抗劑
Daudi人Butt's瘤細胞 Daudi human Butt's lymphoma cells RPMI-1640(GIBCO)+10%FBS鹽酸奧昔布寧(標準品)Oxybutynin HCl質(zhì)量規(guī)格：>98%,標準品
IGFBP5 Protein Cynomolgus 重組食蟹猴 IGFBP5 / IGFBP-5 蛋白 (His 標簽)鹽酸帕羅西汀Paroxetine HCl質(zhì)量規(guī)格：>98%,半水合物
FO(小鼠細胞) 5×106cells/瓶×2 大鼠腹脊髓神經(jīng)元RN-vsc鹽酸帕羅西汀(標準品)Paroxetine HCl質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標準品
胰島β細胞Many types of cells包裝：5 × 105方(1ml)吡羅昔康Piroxicam質(zhì)量規(guī)格：>97%,USP grade
黃綠青霉探針法熒光定量PCR試劑盒人腎上腺皮質(zhì)腺癌細胞;NCI-H295R泰諾福韋;替諾福韋(標準品)Tenofovir質(zhì)量規(guī)格：HPLC≥99%,標準品
HO-8910PM細胞，高轉(zhuǎn)移細胞 人胃粘膜細胞,GES-1細胞 狗肺成纖維樣細胞;DogL1阿那曲唑Anastrozole質(zhì)量規(guī)格：度> 99%,BR，可用于細胞培養(yǎng)
tTA基因修飾的小鼠(B類);P19-CAG-tTA-1F3阿那曲唑(標準品)Anastrozole質(zhì)量規(guī)格：HPLC>98%,標準品
HA Others H5N1 甲型 H5N1 (A/Indonesia/5/2005) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 人細胞裂解液 (陽性對照) 硫酸安普霉素，硫酸阿布拉霉素Apramycin sulfate質(zhì)量規(guī)格：>500U/mg,BR
人肺動脈成纖維細胞HPAF硫酸安普霉素(標準品)Apramycin sulfate質(zhì)量規(guī)格：含量測定
實驗過程：
一、試劑準備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1（10pM） 2μl
引物2（10PM） 2μl
Taq酶（2U/μl） 1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl） 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。
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